흡광도가 높을수록 - heubgwangdoga nop-eulsulog

흡광도를 측정해서 농도를 구하는 작업은 Beer의 법칙에 근간을 두고 이루어 집니다.

Beer의 법칙 : '기체 또는 액체에 의한 빛의 흡수는 그 속의 분자수에 의해서만 결정되며,
희석에 의해서 분자수가 변화하지 않는 한, 희석도(稀釋度)에는 관계가 없다는 법칙이다.
Lambert-Beer의 법칙이라고도 한다.' - 네이버 지식사전낮은 농도에서는 이 Beer의 법칙이 잘 적용되지만, 농도가 높아지면 굴절률이 변하게 되고 결국 '희석도에는 관계가 없다.'가 맞지 않게 됩니다.

시료의 농도가 짙어질 수록 농도와 흡광도가 비례관계가 아니라 log 그래프와 같이
포화되는 형태의 곡선을 보이게 됩니다.
일반적인 spectrophotometer에서 흡광도는 1을 넘어 3~4 이상까지도 측정됩니다.

즉, 흡광도가 1을 넘으면 안되는 이유는 일반적인 spectrophotometer에서는
흡광도 1 이하까지만 농도도 VS 흡광도 곡선이 직선형이기 때문에
흡광도 1 을 넘어가면 직선형 표준곡선이 맞지않기 때문입니다.

또한 너무 낮은 농도에서의 흡광도인 0.0 ~ 0.2 를 표준곡선에 포함시키는 것도 조심해야 합니다.

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1. 실험 제목:분광광도계를 이용한 용액의 농도측정

2. 실험 목적: 분광광도계를 이용하여 빛을 흡수하는 물질이 녹아 있는 용액의 흡광도를 측정한다. 물질의 빛 흡수과정을 흡광도 측정을 통해서 이해한다. 이 실험을 통해서 검정곡선을 만들고, 흡광도 측정을 통해서 미지시료의 농도를 결정한다.

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3. 실험원리

▶ 원 리

일반적으로 빛(백색광)이 물체에 닿으면 그 빛은 ① 물체의 표면에서 반사 ② 물체의 표면에서 조금 내부로 들어간 후 반사 ③ 물체에 흡수 ④ 물체를 통과하는 빛으로 나누어진다. 물체가 흡수하는 빛의 양은 물체의 전부 혹은 일부를 구성하고 있는 빛을 흡수하는 물질의 농도에 따라 다르다. 그러므로 빛의 흡수 정도를 파악하면 시료 용액 중에 있는 빛을 흡수하는 화학물질의 양을 정량 할 수 있다. 이와 같이 방법을 이용하여 시료용액 혹은 적절한 시약으로 발색시킨 용액에서 시약의 농도를 측정하는 방법을 흡광도법이라고 한다. 이런 종류의 실험에 주로 사용하는 빛은 자외선(ultraviolet, 180~320nm) 및 가시광선 (visible, 320~800) 영역에 해당한다.

* 비어의 법칙(Beer’s Law)

<그림 1>에서 보는 것과 같이 빛이 흡광물질이 담겨 있는 용기를 통과하게 되면 시료에 의하여 빛이 흡수되기 때문에 빛의 강도는 약해진다. 시료용액을 통과한 빛의 양(transmittance, T)은 흡광물질이 없을 때 빛의 강도(I0)에 대한 흡광물질이 있을 때 빛의 강도(I)의 비로 나타낸다. 그것을 투과도라 하며, 그것은 T=I/I0로 표시된다. 그러므로 빛의 투과도는 항상 1보다 작으며 다음과 같이 %로 표시될 수 있다.

% T = T × 100

<그림 1> 시료 중에 흡광물질이 없을 때(위)와 없을 때(아래) 투과한 빛의 강도

<그림 2>에서 보는 바와 같이 빛을 흡수하는 물질이 녹아 있는 큐벳(용기)의 직경 또는 폭에 따라서 물질이 빛의 흡수하는 정도(흡광도)가 다르다. 또한 빛의 흡수하는 정도는 물질 고유의 특성에 따라서 다르다. 어떤 물질의 빛 흡수 정도를 나타내는 척도로 몰 흡광계수(molar absorptivity)를 사용하며, 보통은 ε로 표시한다. 그러므로 물질의 빛 흡수 정도는 물질 고유의 특성, 빛이 통과한 거리, 물질의 농도에 비례한다. 이것이 바로 비어의 법칙이며, 다음과 같은 식으로 나타낼 수 있다.

A = ε ×b×c

<그림 2> 큐벳의 직경이 빛의 투과율에 미치는 영향

여기서 A는 흡광도, ε는 물질 고유의 몰 흡광계수, b는 큐벳의 직경 또는 빛이 통과한 거리, c는 흡광 물질의 농도를 말한다. 시료 용액의 흡광도는 대조군(blank test)의 흡광도에 대한 비율이기 때문에 단위가 없으며 시료 용액에 있는 흡광 물질의 농도에 비례한다. 그러므로 표준용액의 농도에 대한 흡광도가 얻어지면 미지시료의 농도를 계산할 수 있다

•흡광도와 투과도의 관계

A = log(I0 / I)

T = I / I0

A = -logT = log(I0 / I)

= 2 – log%T (%T = T * 100)

•흡광도 측정시 파장선택

일반적으로 분광광도법에서 흡광도를 측정할 때 단위 농도당 최대의 흡광이 이루어지는 빛의 파장을 선택한다. 빛의 파장에 따라 흡광도 변화를 추적해 보면 보통의 최대 흡수가 이루어지는 파장을 중심으로 봉우리 형태를 띤다. 그 정점에 해당하는 것이 최대 흡광 파장이며, 그것을 이용하면 최대의 감도를 이끌어 낼 수 있다. 흡광 봉우리 이전 이후에 흡광되는 정도 비슷하기 때문에 최대 흡광 파장을 중심으로 흡광도는 일정하기에 봉우리 부근은 평평한 것이 일반적이다. 이러한 조건에서 흡광도를 측정하면 비어의 법칙을 잘 따른다. 또한 봉우리 부근의 파장을 선택해서 측정하는 경우에 기기의 파장선택이 정밀하지 못해서 발생하는 흡광도의 불확정성은 그다지 크지 않다.

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<그림3> 그림을 보면 최대 흡광도를 나타내는 512 nm 파장을 선택해서 흡광도를 측정하는 이유가 분명해 진다. 만약에 수정으로 만든 큐벳을 사용한다면 205 nm 파장을 선택해서 흡광도를 측정하는 것이 더 좋다. 왜냐하면 더 민감한 측정을 할 수가 있기 때문이다. 이 경우에는 봉우리 끝이 뾰족해서 파장 변화에 따른 흡광도 변화가 클 수 있으므로 주의해야 한다. 한편 어떤 물질이 흡수하는 파장과 우리가 눈으로 보는 색의 파장은 보색관계가 있다. 만약에 512nm에서 빛을 흡수하는 물질을 포함한 용액은 우리 눈에 무슨 색깔로 보일까 생각해 보자.

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<그림 3>. CoCl2의 전체 범위(200-800 nm)에서의 흡광 스펙트럼

* 비어의 법칙을 이용한 농도의 측정(표준검정 곡선법)

<그림 4>은 시료에 있는 흡광 물질 농도를 측정하기 위하여 먼저 표준 검정 곡선을 만들어야 한다. 표준 흡광 물질의 농도가 각각 1.0ppm, 2.0ppm, 3.0ppm, 4.0ppm 되는 표준용액을 만들고, 각 용액의 흡광도를 측정하여 농도대 흡광도를 그림으로 나타낸 것이 표준검정곡선이고, 그림 4에 나타냈다. 만약에 시료의 흡광도가 0.588이었다면 이 표준 검정곡선을 이용하여 시료에 있는 흡광 물질 농도가 2.7ppm이라는 것을 추적할 수 있다

<그림 4>. 표준검정곡선 이용한 시료의 농도 측정

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-흡광도를 측정할 때 주의사항

흡광도를 측정할 때 시료 용액에 있는 흡광물질의 농도가 매우 진하거나 혹은 너무 묽으면 비어법칙이 잘 맞지 않는다. 이와 같은 편차는 일반적으로 농도 변화에 따라 화합물의 양상이 다르게 변화되는 것에 그 근거를 둘 수 있다. 예를 들면 어떤 산, 염기, 염 용액에서 용질의 농도가 묽을수록 그것의 이온화는 증가하는 경향이 있다. 일반적으로 이온의 빛 흡수는 이온화되지 않은 분자들의 흡수는 다르기 때문에 실질적으로 농도 변화가 있는 셈이 된다. 또한 어떤 유기 화합물은 농도의 변화에 따라서 응집되는 경향이 있다. 따라서 흡광도를 측정하여 농도를 결정할 때에는 미지의 농도가 표준 검정 곡선의 일직선상의 범위 내에 있는 농도가 되도록 하는 것이 측정의 오차를 줄일 수 있다. 그렇지만 미지의 농도가 너무 묽거나 너무 진해도 비어의 법칙을 벗어날 수 있음을 유의해야 한다.

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<그림5>. 흡광물질의 농도가 높을 때의 편차

*기기의 구조 및 기능

<그림 6>. 분광광도계

빛을 흡수하는 물질의 흡광도를 측정하는 기구를 분광광도계(Spectrophotometer)라고 한다. 분광광도계는 <그림 6>과 같은 구조로 되어 있다. 분광광도계의 각 구성성분은 흡광분석의 효율을 크게 좌우하기 때문에 각 구성성분의 기능에 대하여 자세히 이해하는 것이 필요하다. 다음은 분광광도계의 주요 부분에 대한 설명이다.

① 광원(光源,light source) : 시료에 포함된 흡광물질 농도를 측정할 때 필요한 파장의 빛을 일정하게 낼 수 있는 등이어야 한다. 대부분의 분광광도계는 가시광선 범위의 스펙트럼 분석에 텅스텐 등을, 자외선 범위의 스펙트럼 분석에는 중수소 등을 사용한다.

② 파장선택장치(wavelength selector) : 광원에서 나오는 빛은 넓은 파장 범위를 갖춘 연속적인 복사선이다. 흡광광도법에서는 시료에 있는 흡광물질이 빛을 최대로 흡수하는 파장을 선택해서 흡광도를 측정하여야 한다. 그러나 단일 파장의 빛을 이용하면 그 강도는 약해지는 반면에 최대 흡수 파장의 범위가 좁을수록 측정의 감도(sensitivity)는 커진다.

③ 큐벳 고정대(Cuvette holder)와 시료실(sample compartment) : 큐벳에 담겨진 시료 용액의 흡광도가 측정되어 지는 곳이다. 파장 선택장치로부터 나오는 일정한 파장의 빛이 시료 용액을 통과하는 장소이다. 외부로부터 들어오는 빛은 반드시 차단되어 있어야 한다.

④ 검출기(detector)와 지시기(readout device) : 시료용액을 통과한 빛 에너지를 전기에너지로 변환하여 시료용액의 흡광도를 나타내는 장치이다

* 큐벳(cuvette)의 사용법과 주의사항

흡광도를 측정할 때, 시료 용액을 담는 용기를 큐벳이라 한다. 가능한 같은 큐벳을 사용하여야 한다. 큐벳 자체의 굴절율, 반사율, 내부두께 등의 서로 다르면 시료의 흡광도 측정에 오차를 발생시킨다. 표준화된 큐벳이란 빛에 대한 굴절율, 반사율 그리고 내부두께 등이 동일한 큐벳을 말한다. 일반적인 기준은 빛의 50%를 통과시키는 용액에서 큐벳 사이에 1%이상의 차이가 없어야 한다. 또한 큐벳은 빛이 통과하는 방향을 기준으로 하여 회전을 할 경우에 굴절율, 반사율, 내부두께 등이 달라질 수 있기 때문에 흡광도를 측정하는 기구(분광광도계)에서 큐벳의 위치는 동일하게 정확히 같은 위치에 놓여야 한다. <그림 5>에서 보는 바와 같이 큐벳의 세로선은 분광광도계 큐벳 고정대의 세로선에 일치하게끔 놓아야 한다. 큐벳에 흠이 있거나 지문, 용매 등이 묻어 있을 경우에도 역시 흡광도에 영향을 주기 때문에 잘 닦아야 한다.

<그림 7>. 분광광도계에서 큐벳의 올바른 위치

*분광광도계 사용시 주의 사항

분광광도계를 사용하여 시료의 흡광도를 측정할 때 바탕시험(blank test) 용액을 만들어야한다. 바탕 용액은 흡광물질을 제외하고는 시료 용액과 반드시 동일한 성분이 유지될 수 있도록 만들어야 한다. 왜냐하면 시료 용액에 관심이 있는 흡광물질 이외에도 빛의 흡수에 영향을 미치는 물질이 들어 있을 수도 있기 때문이다. 분광광도계는 반드시 빛의 투과율(%T)을 보정한 후에 사용하여야 한다. 즉 바탕용액에는 흡광 물질이 포함되어 있지 않고, 광원으로부터 나오는 빛을 100% 통과시키는 것이라고 가정하고 바탕용액의 통과율이 100%T가 되도록 보정한다. 또한 광원으로부터 나온 빛이 모두 흡수되어 검출기에 전혀 닿지 않는다면 통과율은 0%T가 될 것이기 때문에 이와 같은 조건에서 통과율이 0%T가 되도록 보정한다.

그림8. Spectronic 20D+그림9 . Metertek SP-850

4. 기구 및 시약

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a. 기 구 : 분광광도계(Spectronic 20), 10㎖ 눈금실린더, 측정용기(큐벳, cuvette) 2개, 피펫 시험관 받침대, 세척병, 시험관 6개, 비이커

b. 시 약 : 0.1M CoCl2 수용액

5. 실험방법

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(Metertek SP-850 사용시)

1. 분광광도계를 일정시간(15분정도) 예열한다.

2. 분광광도계의 파장을 512nm(최대 흡수파장)에 맞춘다. (최대 흡수파장)

3. 0.1M CoCl2 표준용액을 30ml 취한 후 5개의 시험관을 준비한다.

4. 10ml 눈금실린더에 0.1M CoCl2 표준용액을 준비한 5개의 시험관에 각각 2.0ml, 4.0ml, 6.0ml, 8.0ml, 10ml를 취한 뒤 증류수를 가하여 10ml로 묽힌다.

5. 분광광도계에 증류수를 채운 시료용기를 넣고, 뚜껑을 닫은 후 ‘100%T OA' 버튼을 눌러 100% 투과도가 되도록 조절한다.

6. 4에서 준비한 각각의 용액을 시료용기에 넣고 투과도를 측정한다.

7. 미지시료의 투과도를 측정한다.

8. X축은 농도, Y축은 흡광도인 표준 검정곡선을 작성한다.(엑셀 사용)

9. 검정곡선을 이용하여 미지시료의 농도를 예측한다.

(Spectronic 20D+ 사용시)

1. 분광광도계를 일정시간(15분정도) 예열한다. (0%T버튼을 오른쪽으로 돌리면 커진다.)

2. 분광광도계의 파장을 512nm(최대 흡수파장)에 맞춘다.

3. 0.1M CoCl2 표준용액을 30ml 취한 후 5개의 시험관을 준비한다.

4. 10ml 눈금실린더에 0.1M CoCl2 표준용액을 준비한 5개의 시험관에 각각 2.0ml, 4.0ml, 6.0ml, 8.0ml, 10ml를 취한 뒤 증류수를 가하여 10ml로 묽힌다.

5. 뚜껑이 닫힌 상태에서 0%T로 투광도가 0이 되도록 한다.

6. 분광광도계에 증류수를 채운 시료용기를 넣고, 100%T로 투광도가 100 이 되도록 한다.

7. 4에서 준비한 각각의 용액을 시료용기에 넣고 투과도를 측정한다.

8. 미지시료의 투과도를 측정한다.

9. X축은 농도, Y축은 흡광도인 검정곡선을 작성한다.(엑셀 사용)

10. 검정곡선을 이용하여 미지시료의 농도를 예측한다.

6. 실험결과

실제 미지시료의 농도

1 mol

1.523g ⅹ ------------------

237.93g

------------------------------------------- = 0.032 M(mol/L)

1L

200ml x ------------------

1000ml

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검정곡선에 의한 미지시료의 농도

미지시료의 농도 = 0.175 + 0.0003 / 5.35

= 0.033M

참고문헌

https://www.youtube.com/watch?v=xHQM4BbR040(분광 광도계, spectrophotometer)

분석화학 Daniel C. Harris 자유아카데미(분광광도법)